Дизайн химерных молекул, повышающих субстратную селективность АМФК

Большое спасибо за вопрос. Оценка влияния линкера проводилась с точки зрения сохранения целевой активности. Сборка химерной молекулы осуществляется следующим образом: к активатору АМФК пришивается аминокислотный фрагмент через амино группу, затем получается сложный эфир с ингибитором MDM2. В предыдущих исследованиях мы уже проводили модификацию рассматриваемых ингибиторов MDM2 аминокислотными фрагментами и показали, что функционализация этих соединений по свободной гидроксильной группе не приводит к потере целевой активности. В рамках данного проекта мы проверяли АМФК-стимулирующую активность активаторов АМФК, модифицированных аминокислотными фрагментами по свободной карбоксильной группе, методами in silico и in vitro. Выбор данного типа линкерного фрагмента из всего многообразия линкеров, используемых в молекулах PROTAC, определялся в первую очередь наличием функциональных групп, позволяющих модифицировать обе исследуемые молекулы (активатора и ингибитора), возможностью варьирования длины и доступностью. В нашем случае мы использовали аминомасляную и аминокапроновую кислоту для получения линейки из шести линкеров разной длины, при этом исходные кислоты обладают полезными фармакологическими свойствами. Анализ литературных данных, в которых для такого типа химерных молекул (АМФК-PHICS) отмечается оптимальная длина линкера как такового, содержащего цепочку из пяти углеродных атомов, позволяет нам предположить большую эффективность химерных молекул с более длинным линкерным фрагментом, так как мы работаем с отличным от используемого в литературе типом активаторов АМФК (блокаторы автоингибиторного домена). Однако, говорить об оптимальности того или иного линкера мы сможем только по завершении исследований целевого эффекта (апоптоз), которые начнутся в ближайшее время.

При выборе линкера мы исходили из того, какие молекулы нам нужно будет объединить – в данной работе это ингибиторы MDM2 и активаторы АМФК, у которых имеются функциональные гидрокси и карбокси группы, соответственно. Предложенные аминокислоты имеют необходимые функциональные группы, они неиммуногенные, с ними достаточно удобно работать, путем их комбинации легко варьировать длину линкерного фрагмента.
Минимальное изменение свойств активных фрагментов обеспечивается за счет тщательного выбора места пришивки. Это необходимо для того, чтобы для используемой активной молекулы не нарушалось соответствие фармакофорной гипотезе, разработанной для данной мишени. Способы связывания малых молекул с АМФК и MDM2 нами были хорошо изучены с компьютерной точки зрения, кроме того проводились клеточные эксперименты молекул с линкерами на модели активации АМФК, при этом степень активации АМФК снижалась, но незначительно. Насколько изменится целевая активность собранной химерной молекулы относительно отдельных мишеней, нам еще предстоит выяснить.
В заключении хотелось отметить, что наиболее эффективный способ подбора линкера все же эмпирический. В рамках большого проекта мы планируем попробовать также другие типы линкеров, чтобы иметь свое понимание о степени важности данного структурного элемента в рамках предложенной нами химерной молекулы.